Activity Axes 3: Regenerative Medicine Print E-mail

Συντονιστής: N. Ζούμπος
Συμμετέχοντα μέλη του δικτύου: Α. Αθανασιάδου, Ν. Ζούμπος, Α. Μουζάκη, Η. Παναγιωτόπουλος, Α. Σπυριδωνίδης

Εισαγωγή
Η αναγεννητική ιατρική είναι ένας νέος τρόπος θεραπείας τραυμάτων και ασθενειών που αξιοποιεί καλλιεργημένους ιστούς και κύτταρα (που συμπεριλαμβάνουν βλαστικά κύτταρα ή/και γενετικά τροποποιημένα κύτταρα), εργαστηριακά παρασκευάσματα ή/και τεχνητά όργανα. Η αναγεννητική ιατρική είναι ένα νέο πεδίο της ιατρικής που απαιτεί την συνεργασία επιστημόνων διαφορετικών ειδικοτήτων οι οποίες περιλαμβάνουν την κλινική ιατρική, τη βιολογία, τη χημεία, τη γενετική, την πληροφορική, τη μηχανική, τη ρομποτική. Η σύγχρονη, ολοένα εμπλουτιζόμενη, γνώση σχετικά με τη βιολογία των αδιαφοροποίητων βλαστοκυττάρων και η πρόσφατη ολοκλήρωση του προγράμματος ανάλυσης του γονιδιώματος του ανθρώπου, έχουν συμβάλλει στο σχεδιασμό και την εφαρμογή πρωτοποριακών κυτταρικών και γονιδιακών θεραπειών για την αντιμετώπιση διαφόρων κακοήθων όσο και μη κακοήθων, εκφυλιστικών παθήσεων. Η έρευνα των κυτταρικών και γονιδιακών θεραπειών εστιάζεται στην κατανόηση του μηχανισμού της κυτταρικής διαφοροποίησης και του βιολογικού ρόλου των γονιδίων και των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Οι κυτταρικές και γονιδιακές θεραπείες θα αποτελέσουν, στο άμεσο μέλλον, το πλέον υποσχόμενο θεραπευτικό όπλο της ιατρικής.

Α. Κυτταρική θεραπεία
(Υπεύθυνη: Α. Μουζάκη)
Η κυτταρική θεραπεία ως θεραπευτική αγωγή αφορά τη μεταμόσχευση υγιών κυττάρων τα οποία υποκαθιστούν ή αντικαθιστούν κατεστραμμένους ιστούς ή κύτταρα. Μερικές από αυτές τις τεχνολογίες έχουν ήδη εισαχθεί στην κλινική πρακτική, όπως η αλλογενής μεταμόσχευση μυελού των οστών, ενώ άλλες βρίσκονται σε προκλινικό ερευνητικό στάδιο ή στο στάδιο των κλινικών δοκιμών. Παραδείγματα αποτελούν οι κυτταροθεραπείες με δενδριτικά κύτταρα για την καταπολέμηση του καρκίνου, οι κυτταροθεραπείες με Τ-λεμφοκύτταρα για την καταπολέμηση διαφόρων θανατηφόρων λοιμώξεων και ανοσοανεπαρκειών, η χορήγηση χονδροκυττάρων για αντιμετώπιση ορθοπεδικών παθήσεων, οι κυτταροθεραπείες για την αντιμετώπιση εκφυλιστικών παθήσεων της καρδιάς (έμφραγμα μυοκαρδίου, συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, περιφερική αγγειοπάθεια), του νευρικού συστήματος (πολλαπλή σκλήρυνση ανθιστάμενη στην θεραπεία με ιντερφερόνη, εγκεφαλική παράλυση, μυασθένεια), του ήπατος (κίρρωση του ήπατος), και του παγκρέατος (διαβήτης τύπου 1).
Για την κυτταρική θεραπεία, απομονώνονται στελεχιαία ή διαφοροποιημένα κύτταρα τα οποία καλλιεργούνται κάτω από ειδικές συνθήκες (Good Manufacturing Practice, GMP, κριτήρια) που ελαχιστοποιούν την βακτηριακή ή άλλη μόλυνση των ληφθέντων ιστών και κυττάρων. Με την εφαρμογή κατάλληλων εργαστηριακών πρωτοκόλλων, δημιουργούνται μοσχεύματα ή κύτταρα κατάλληλα για θεραπευτικές εφαρμογές όπως: ανάπλαση αρθρικού χόνδρου, δέρματος, αποκατάσταση τραυματισμένου νωτιαίου μυελού, μεταμόσχευση στελεχιαίων αιμοποιητικών κυττάρων (σε αιματολογικούς ασθενείς ή ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα ανθεκτικά σε φαρμακευτικές αγωγές), ενδυνάμωση του ανοσοποιητικού συστήματος (μετά από τοξικές θεραπείες σε ογκολογικούς ασθενείς ή σε ασθενείς με ανοσοανεπάρκεια), αποκατάσταση νευρολογικών παθήσεων όπως η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, επιληψία, κ.α.
Ανάλογα με την εφαρμογή, η κυτταρική θεραπεία μπορεί να είναι σχετικά απλή ή αρκετά πολύπλοκη. Η κυτταρική θεραπεία είναι σχετικά απλή όταν η διαδικασία αφορά τον πολλαπλασιασμό διαφοροποιημένων κύτταρων του ιδίου του ασθενούς τα οποία πρέπει να μεταφερθούν σε σημεία εύκολης πρόσβασης με απλούς κλινικούς χειρισμούς. Για παράδειγμα, για την ανάπλαση αρθρικού χόνδρου απαιτείται η απομόνωση υγίων χονδροκυττάρων από τον ίδιο τον ασθενή, η καλλιέργειά τους στο εργαστήριο για 3-4 βδομάδες σε ειδικά καλλιεργητικά υλικά ώστε να πολλαπλασιαστούν και η έγχυσή τους στην περιοχή της κατεστραμμένης άρθρωσης (μέθοδος εγκεκριμένη από το FDA στις ΗΠΑ). Κάτι αντίστοιχο μπορεί να γίνει για να δημιουργηθεί νέο επιθήλιο για αποκατάσταση κατεστραμμένου δέρματος π.χ. σε ασθενείς που φέρουν εκτεταμένα εγκαύματα. Αντίθετα, όταν απαιτείται η δημιουργία νέων κυττάρων και ιστών ξεκινώντας από στελεχιαία κύτταρα, απαιτούνται πολύπλοκα και χρονοβόρα εργαστηριακά πρωτόκολλα και κλινικοί χειρισμοί μεγάλης ακρίβειας που πρέπει να εξασφαλίσουν ότι: α. τα στελεχιαία κύτταρα είναι όσο αρχέγονα χρειάζεται ώστε να μπορούν να διαφοροποιηθούν και να δώσουν τον κατάλληλο κυτταρικό τύπο για τη συγκεκριμένη εφαρμογή (π.χ. αποκατάσταση τραυματισμένου νωτιαίου μυελού και χρόνιων και εκφυλιστικών νευρολογικών παθήσεων), και β. τα κύτταρα που δημιουργήθηκαν, φθάνουν ή εμφυτεύονται στη σωστή περιοχή για να δημιουργήσουν τον κατάλληλο ιστό.
Τρέχουσες και προγραμματιζόμενες εργασίες στα πλαίσια του Δικτύου

Οι ερευνητές (με αλφαβητική σειρά) που αποτελούν την πυρηνική ομάδα κυτταρικής θεραπείας είναι οι:
·     Ζούμπος Νικόλαος, Αιματολόγος, Καθηγητής Αιματολογίας
·     Μουζάκη Αθανασία, Ανοσοβιολόγος, Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας-Αιμοδοσίας
·     Παναγιωτόπουλος Ηλίας, Ορθοπεδικός Χειρουργός, Καθηγητής Ορθοπεδικής (σε συνεργασία με τον Επίκουρο Καθηγητή Νευροχειρουργικής κο Γ. Γκαζούνη) και
·     Σπυριδωνίδης Αλέξανδρος, Αιματολόγος, Επίκουρος Καθηγητής Αιματολογίας-Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών
Τα μέλη της ομάδας Ζούμπου-Μουζάκη-Σπυριδωνίδη έχουν ήδη ανεπτυγμένα ερευνητικά εργαστήρια αιματολογίας και ανοσολογίας στα οποία μέλη του προσωπικού της Αιματολογικής Κλινικής και μεταπτυχιακοί και προπτυχιακοί φοιτητές διεξάγουν έρευνα και εκπονούν διδακτορικές διατριβές, μεταπτυχιακές και διπλωματικές εργασίες.
Παράλληλα, η ομάδα Μουζάκη- Παναγιωτόπουλου/Γκατζούνη συνεργάζονται ερευνητικά για περισσότερο από ένα έτος, σε πρωτόκολλα που αναλύουν τους κυτταρικούς και μοριακούς μηχανισμούς που οδηγούν στην έκτοπη οστεοποίηση μετά από κρανιοεγκεφαλική κάκωση, εστιάζοντας στην ανίχνευση και τις ιδιότητες πρώιμων οστεοβλαστικών κυττάρων στο αίμα ασθενών και πειραματοζώων. Επιπλέον, έχουν ξεκινήσει ερευνητική συνεργασία που θα οδηγήσει στη δυνατότητα εφαρμογής κυτταρικών θεραπειών σε ασθενείς με κακώσεις στη σπονδυλική στήλη που θα φιλοξενούνται στο υπό κατασκευή Κέντρο Αποκατάστασης του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών.
Πρόσφατα (11/2008) η ομάδα Ζούμπου-Μουζάκη-Σπυριδωνίδη κατέθεσε μελέτη για τον απαιτούμενο επιπλέον εξοπλισμό που χρειάζεται να αποκτηθεί για να δώσει την δυνατότητα ανάπτυξης και παροχής πρωτοποριακών κυτταρικών και γονιδιακών θεραπειών στο Πανεπιστήμιο Πατρών (bench to bedside research, βλ. Προγραμματιζόμενος εξοπλισμός). O αιτούμενος εξοπλισμός θα συμβάλλει στην κατανόηση του μηχανισμού της κυτταρικής διαφοροποίησης και του τρόπου λειτουργίας των γονιδίων και στην ανάπτυξη υποδομών στο Πανεπιστήμιο Πατρών εναρμονισμένων πλήρως στις απαιτήσεις "καλής κλινικής πρακτικής" (GMP) όπως ορίζονται από τις κοινοτικές οδηγίες (2004/23/ΕΚ; 2006/17/EK). Η ύπαρξη μονάδος GMP θα συμβάλλει στην άμεση συνεργασία του προκλινικού ερευνητή με τον κλινικό ερευνητή στην εφαρμογή ενός ολοκληρωμένου ερευνητικού προγράμματος κυτταρικών και γονιδιακών θεραπειών, θα χρησιμοποιηθεί από διάφορες προκλινικές και κλινικές ερευνητικές ομάδες και θα αναπτυχθεί στη μορφή του core facility, δηλ. την ύπαρξη βασικού εξοπλισμού προσβάσιμου σε κάθε ερευνητική ομάδα ανάλογα με τις ανάγκες της. Στο πλαίσιο αυτό θα πραγματοποιηθούν οι αναγκαίες τεχνικές μελέτες για την δημιουργία Μονάδας GMP στο υπό κατασκευή κτίριο Δ του Ιατρικού Τμήματος στο οποίο έχει δοθεί κατάλληλος χώρος. Η υποδομή θα αξιοποιηθεί, αρχικά, από την Αιματολογική Κλινική για μεταμόσχευση μυελού των οστών και αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και την Ορθοπεδική Κλινική για κυτταρική θεραπεία στα πλαίσια του Κέντρου Αποκατάστασης Παραπληγικών Ατόμων, ενώ θα μπορεί να αξιοποιηθεί & από όλες τις Κλινικές που μπορούν να εφαρμόσουν κυτταρικές και γονιδιακές θεραπείες.

Β. Γονιδιακή θεραπεία
(Υπεύθυνη: Α. Αθανασιάδου)
H γονιδιακή θεραπεία στοχεύει στην τροποποίηση του γενετικού υλικού κυττάρων του ανθρώπου για θεραπευτικούς σκοπούς, με τη μεταφορά εξωγενούς γονιδίου. Το 2000 ανακοινώθηκε η πρώτη επιτυχής κλινική μελέτη σε παιδιά με σοβαρή, συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID), μετά από γονιδιακή θεραπεία (Hacein-Bey-Abina et al 2002), συγχρόνως όμως εμφανίστηκαν σοβαρές παρενέργειες, ως άμεση συνέπεια της γονιδιακής μεταφοράς με ρετροϊικό φορέα σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Οι εξελίξεις αυτές έδειξαν ότι ο περιοριστικός παράγοντας στην επιτυχή εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας είναι η έλλειψη φορέων που να χαρακτηρίζονται από αποτελεσματικότητα και ασφάλεια. Η γονιδιακή θεραπεία παρά τα προβλήματα, φέρει την προσδοκία αντιμετώπισης ασθενειών για τις οποίες δεν υπάρχει αποτελεσματική συμβατική θεραπεία και η έρευνα προς την ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων φορέων γονιδιακής μεταφοράς είναι περισσότερο επίκαιρη από ποτέ. 
Οι ιϊκοί φορείς αποτελούν τα πλέον διαδεδομένα και μελετημένα συστήματα γονιδιακής μεταφοράς, και εξασφαλίζουν την συγκράτηση του στο κύτταρο και τη μεταβίβαση του στα θυγατρικά κύτταρα, με ενσωμάτωση του DNA τους στα χρωματοσώματα του κυττάρου. Η μεταλλαξιγένεση ενσωμάτωσης (insertional mutagenesis), λόγω πρόκλησης μεταλλάξεων στην δομή και την έκφραση ενδογενών γονιδίων δίπλα ή μέσα στα οποία ενσωματώνεται το μεταφερόμενο DNA, αποτελεί σήμερα το κύριο πρόβλημα της χρήσης ρετροιϊκών φορέων
Οι Μη ιϊκοί φορείς, είναι συνήθως πλασμιδιακό DNA, δεν παρουσιάζουν ειδικότητα ως προς τα κύτταρα - στόχους και μπορούν δυνητικά να διαμολύνουν κύτταρα οποιουδήποτε ιστού ή οργάνου.Το κυριότερο πλεονέκτημα τους είναι η ασφάλεια της χρήσης τους και οι ανεπιθύμητες ενέργειες που προέκυψαν από τα ιϊκά συστήματα, οδήγησαν σε μια εκθετική αύξηση της χρήσης τους σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας in vitro και in vivo. Ωστόσο, η μη ιϊκή γονιδιακή μεταφορά σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα (HSCs) είναι περιορισμένη λόγω χαμηλότερης απόδοσης
Οι αναπαραγώμενοι επισωματικoί φορείς ανήκουν στους μη ιϊκούς φορείς. Τέτοιοι φορείς παραμένουν στον πυρήνα του κυττάρου - ξενιστή ως αυτόνομα αναπαραγόμενες μονάδες χωρίς να ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα του κυττάρου και έτσι δεν διαταράσσουν τα μεταγραφικά προγράμματα του κυττάρου - ξενιστή (Lipps and Bode 2001, Lipps et al 2003), βασίζονται δε σε γενετικά στοιχεία ιών που αναπαράγονται επισωματικά φυσιολογικά, κατά τη λανθάνουσα μόλυνση κυττάρων. Ο επισωματικός φορέας pEPI-1 περιέχει ένα στοιχείο S/MAR. Τα S/MAR αλληλεπιδρούν με την πυρηνική θεμέλια ουσία και παίζουν ρόλο στη διαμόρφωση των ορίων ανεξάρτητων περιοχών χρωματίνης. Πιστεύεται ότι η λειτουργία του pEPI-1 ως σταθερού επισώματος απουσία του T-Ag, βασίζεται στο ότι το S/MAR έχει την ικανότητα να στρατολογεί παράγοντες του κυττάρου οι οποίοι διαμεσολαβούν τόσο τη μιτωτική του σταθερότητα όσο και την επισωματική του αντιγραφή, σε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και τρωκτικών.

Τρέχουσες και προγραμματιζόμενες εργασίες στα πλαίσια του Δικτύου
Οι εργασίες άρχισαν από το 2002 ως ένα Πρόγραμμα συνεργασίας μεταξύ της Αιματολογικής Κλινικής (Καθηγ. Ν. Ζούμπος και συνεργάτες) και του Εργαστηρίού Γενικής Βιολογίας (Καθηγ. Α. Αθανασιάδου και συνεργάτες). Το πρόγραμμα το οποίο συνεχίζεται, στοχεύει στην μελέτη υπαρχόντων και στη δημιουργία νέων επισωματικών (μη-ιϊκών) φορέων γονιδιακής μεταφοράς, για την γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών. Περιλαμβάνει τη γονιδιακή μεταφορά των επισωματικών φορέων 1) σε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές αιματολογικής προέλευσης (K562, MEL) και 2) κύτταρα CD34+, ως ο τελικός δέκτης της γονιδιακής μεταφοράς στις αιμοσφαιρινοπάθειες. Μέχρι τώρα, αυτή η συνεργασία έχει αποφέρει τρεις δημοσιεύσεις:
1) Papapetrou EP, Zoumbos NC, Athanassiadou,A.(2005). Genetic modification of hematopoietic stem cells with non-viral systems: past progress and future prospects. Gene Therapy, S118-30
2) Papapetrou EP, Ziros, PG, Micheva ID, Zoumbos, NC, Athanassiadou, A (2006). Gene transfer into human hematopoietic progenitor cells with an episomal vector carrying a S/MAR element. Gene Therapy, 13(1):40-51,
3) Giannakopoulos A, Stavrou E.F, Zarkadis I, Zoumbos N, Thrasher AJ, Athanassiadou A. The functional role of S/MARs in EBV-based episomal vectors as defined by the stress-induced destabilization profile of the vector backbone sequences Journal of Molecular Biology, in press.
Αναλυτικότερα, έχει μελετηθεί το πρότυπο του φορέα pEP1-eGFP-S/MAR σε κύτταρα CD34+ (Papapetrou et al 2005, 2006), όπου δείχθηκε ότι ο φορέας είναι σε θέση να διαμολύνει τα εν λόγω κύτταρα με επάρκεια 25 -30 % και να επιτρέπει την έκφραση του γονιδίου αναφοράς. Επίσης, έχει μελετηθεί ο ρόλος του S/MAR, μέσω του υπολογισμού της SIDD (stress-induced duplex destabilization). Με βλαση τα αποτελέσματα, διατυπώνεται η άποψη ότι το S/MAR ασκεί την σταθεροποιητική του δράση σε συνάρτηση με τις παρακείμενες αλληλουχίες και πρέπει να συνοδεύεται από τουλάχιστον άλλη μία περιοχή με δυνατότητα «αποσταθεροποίησης» της διπλής έλικας για την μηχανή του διπλασιασμού ή της αντιγραφής του DNA (Giannakopoulos et al 2009).

Για το προσεχές διάστημα προγραμματίζονται:
α) Δημιουργία φορέων με εναλλακτικούς υποκινητές:

Προκειμένου να αντιμετωπισθεί η χαμηλή έκφραση eGFP λόγω αποσιώπησης του υποκινητή CMV, θα δημιουργηθούν και θα αναλυθούν φορείς που φέρουν εναλλακτικούς υποκινητές: pEPI-pSFFV και pEPI-EF1/HTLV με αντικατάσταση του υποκινητή CMV του γονιδίου eGFP στον επισωματικό φορέα pEPI, εναλλακτικά από τούς υποκινητές SFFV (spleen focus forming virus) και EF1/HTLV (hybrid elongation factor 1a/human T-cell leukemia virus), οι οποίοι έχουν δειχθεί ότι είναι ισχυροί και σε κύτταρα CD34+.
β) Γονιδιακή μεταφορά για την ενεργοποίηση του γονιδίου γ-σφαιρίνης.
Η ενεργοποίηση του γονιδίου της γ σφαιρίνης, μετά από γονιδιακή μεταφορά τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα, είναι μια νέα στρατηγική προσέγγισης στη γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών, σε αντιδιαστολή προς την ιϊκή μεταφορά του γ- ή β-σφαιρινικού γονιδίου. Το πρόγραμμα περιλαμβάνει την ανάπτυξη επισωματικού φορέα γονιδιακής μεταφοράς ενός τεχνητού παράγοντα- gg1-VP64-HA- ενεργοποίησης της γ-σφαιρίνης σε κύτταρα CD34+ ομφάλιου λώρου αλλά και κύτταρα που προέρχονται από προκαταρκτική μελέτη ασθενών για τον προσδιορισμό των παραμέτρων σχεδιασμένης ιϊκής γονιδιακής μεταφοράς του φυσιολογικού β-γονιδίου. Το πρόγραμμα αυτό εκτελείται στο πλαίσιο εγκεκριμένου Προγράμματος κλινικής δοκιμασίας της Γονιδιακής Θεραπείας της νόσου στη χώρα μας (συνεργασία με την Δρ Γιαννάκη Ε. Γεν. .Νοσ. «Γ. Παπανικολάου» στη Θεσσαλονίκη.

 


Powered by Joomla! Σχεδίαση - Ανδρέας Παπαδόπουλος