Activity Axis 2: Animal and Cell Models Print E-mail

Συντονιστής: Σ. Ταραβήρας
Συμμετέχοντα μέλη του Δικτύου: Π. Γιομπρές, Ζ. Λυγερού, Θ. Μανδαμαδιώτης, Α. Μητσάκου, Κ. Σταθόπουλος, Σ. Ταραβήρας, Ι. Χαμπαίος, Θ. Χριστόπουλος

Εισαγωγή
Πρόκληση στη μεταγονιδιωματική έρευνα αποτελεί η μετάβαση από τη γνώση της αλληλουχίας του DNA του ανθρώπινου γονιδιώματος στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της παθογένειας των ασθενειών και στη μετάφραση της γνώσης αυτής σε πρώιμη και έγκυρη διάγνωση και αποτελεσματική θεραπεία. Η σύγχρονη βιοιατρική έρευνα στοχεύει στην ανάδειξη των βιομορίων που ενέχονται στους μηχανισμούς ανάπτυξης ανθρώπινων ασθενειών με σκοπό να πιστοποιηθούν νέοι θεραπευτικοί στόχοι, προγνωστικοί και διαγνωστικοί βιοδείκτες.
Προς αυτή την κατεύθυνση, η ανάπτυξη και χρήση κυτταρικών και ζωικών μοντέλων είναι καθοριστική για τη διερεύνηση του βιολογικού ρόλου των γονιδίων, την ταυτοποίηση μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθοβιολογία ασθενειών και την ανακάλυψη και δοκιμή νέων φαρμάκων και θεραπειών. Η ανάπτυξη ζωικών μοντέλων που θα μιμούνται την παθοβιολογία ανθρώπινων ασθενειών αποτελεί έναν από τους κύριους άξονες της σύγχρονης βιοιατρικής έρευνας. Τα ζωικά μοντέλα, προϊόντα γενετικής τροποποίησης, τυχαίας μεταλλαξιγένεσης ή πειραματικών χειρισμών, χρησιμοποιούνται για τη μελέτη μοριακών παθογενετικών μηχανισμών ανθρώπινων ασθενειών αλλά και για τη δοκιμή νέων φαρμακολογικών και κυτταρικών θεραπειών. Παράλληλα, αναπτύσσονται μεθοδολογίες που επιτρέπουν τη μελέτη της πρωτεϊνικής λειτουργίας σε ζωντανά κύτταρα, αλλά και την ανάπτυξη νέων κυτταρικών συστημάτων μελέτης καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων.
Με στόχο την κατανόηση των βασικών κυτταρικών μηχανισμών τόσο σε μοριακό/κυτταρικό επίπεδο όσο και σε επίπεδο λειτουργίας ενός οργάνου, τα μέλη του Δικτύου έχουν δημιουργήσει κυτταρικά συστήματα μελέτης και ζωικά μοντέλα που μιμούνται ανθρώπινα νοσήματα (νευρολογικές, νευροεκφυλιστικές, μεταβολικές, δυσλειτουργίας του ανοσοποιητικού, καρκίνου) ενώ δραστηριοποιούνται στην ανάπτυξη καινοτόμων τεχνολογιών για τη μελέτη κυτταρικών και ζωικών μοντέλων ασθενειών.

Τρέχουσες Δραστηριότητες
Ζωικά Μοντέλα
Στόχος των δράσεων είναι η κατανόηση των βιολογικών μηχανισμών που ελέγχουν τη λειτουργία του λιπώδους ιστού, του νευρικού και ανοσοποιητικού συστήματος, και του τρόπου που αυτοί εμπλέκονται στη παθοβιολογία ασθενειών όπως ο καρκίνος, νευροεκφυλιστικές νόσοι, ανοσοανεπάρκεια, μεταβολικό σύνδρομο κα. Για τις μελέτες έχουν αναπτυχθεί τα ακόλουθα «εργαλεία»:
1. Διαγονιδιακοί μύες οι οποίοι επιτρέπουν την υπό συνθήκη αδρανοποίηση (conditional knock out) κεντρικών ρυθμιστών κυτταρικών διεργασιών, όπως ο μεταγραφικός παράγοντας CREB και ο ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου Geminin.
2. Μύες στους οποίους έχουν αδρανοποιηθεί τα γονίδια των μεταγραφικών παραγόντων Nrf2 και Keap1, όπως επίσης και αντίστοιχες πρωτογενείς καλλιέργειες από τους ανωτέρω μύες που διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα και ηπατοκυττάρα.
3. Σειρές διαγονιδιακών μυών που εκφράζουν ιστοειδικά την ρεκομπινάση Cre σε ηπατοκύτταρα, κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος, κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος κα. Σειρές διαγονιδιακών μυών που εκφράζουν διαγονίδια μάρτυρες (όπως YFP κα) για λειτουργικές μελέτες.
4. Ζώα που μιμούνται την ασθένεια Πάρκινσον μετά από χορήγηση χημικών ουσιών (6-OHDA).
5. Πρωτόκολλο για στερεοταξική χορήγηση κυττάρων σε συγκεκριμένα τμήματα του εγκεφάλου.
Κυτταρικά μοντέλα
Μέλη του άξονα δραστηριοποιούνται επί σειρά ετών στην:
1. Ανάπτυξη και εφαρμογή μεθοδολογιών λειτουργικής απεικόνισης βιομορίων σε ζωντανά κύτταρα και ιστούς.
2. Ανάπτυξη κυτταρικών σειρών που εκφράζουν πρωτεΐνες συντηγμένες με φθορίζουσες πρωτεΐνες (GFP, CFP, YFP, RFP, photoactivatable GFP κα)
3. Ανάπτυξη καλλιεργειών αρχέγονων/προγονικών νευρικών κυττάρων και εξωγενή έκφραση γονιδίων μετά από διαμόλυνση με ρετροϊούς. Χρήση για έλεγχο βιοδραστικότητας νέων φαρμακολογικών ουσιών.
4. Ανάπτυξη κυτταρικών συστημάτων δοκιμής φαρμάκων

Συνεργασίες
Τα μέλη του άξονα έχουν ήδη κοινή ερευνητική δραστηριότητα: δημοσιεύσεις (Σ. Ταραβήρας, Θ. Μανδαμαδιώτης, Ζ. Λυγερού), ανακοινώσεις (Σ. Ταραβήρας, Α. Μητσάκου, Π. Γιομπρές, Ζ. Λυγερού, Ι. Χαμπαίος) και ερευνητικά προγράμματα (Σ. Ταραβήρας, Α. Μητσάκου, Π. Γιομπρές, Ι. Χαμπαίος, Ζ. Λυγερού), γεγονός που συντελεί στην ομοιογένεια και αποτελεσματικότητα του Δικτύου. Τα μέλη του συγκεκριμένου άξονα έχουν επίσης κοινές εκπαιδευτικές δραστηριότητες πχ. διδασκαλία στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα των Βασικών Ιατρικών Επιστημών, στην επίβλεψη μεταπτυχιακών διπλωμάτων εξειδίκευσης καθώς και διδακτορικών διατριβών.

Στόχοι
Ερευνητικοί και Αναπτυξιακοί στόχοι

·     Πρόσφατες μελέτες σε ψρια και σε μύες δείχνουν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας CREB ρυθμίζει εκτός της διαφοροποίησης και τον πολλαπλασιασμό αρχέγονων/προγονικών κυττάρων του νευρικού συστήματος. Μύες στους οποίους μέλη του δικτύου έχουν αδρανοποιήσει ιστοειδικά το γονίδιο CREB εμφανίζουν αυξημένο κυτταρικό θάνατο μεταμιτωτικών νευρώνων μιμούμενα νευροεκφυλιστικές νόσους στον άνθρωπο. Στόχος είναι η μελέτη μορίων που εμπλέκονται στο σηματοδοτικό μονοπάτι cAMP/CREB προκειμένου να κατανοηθεί ο μηχανισμός του κυτταρικού θανάτου στα συγκεκριμένα ζώα και να διερευνηθεί εάν αντίστοιχα μοριακά μονοπάτια ευθύνονται και για τις αντίστοιχες ανθρώπινες ασθένειες. Ταυτόχρονα τα ποντίκια αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για τη δοκιμή νέων θεραπειών σε νευροεκφυλιστικές νόσους και καρκίνο του εγκεφάλου.
·     Η ιστοειδική αδρανοποίηση του γονιδίου της Geminin στο περιφερειακό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ) προκαλεί μείωση των πρόδρομων κυττάρων του εντερικού νευρικού συστήματος (ΕΝΣ) το οποίο οδηγεί σε φαινότυπο που ομοιάζει με τη νόσο Hirschsprung. Η κατανόηση των μηχανισμών που συντελούν στη μείωση των πρόδρομων κυττάρων του ΕΝΣ θα συντελέσει στην κατανόηση του παθογενετικού μηχανισμού της συγκεκριμένης νόσου. Οι συγκεκριμένοι μύες μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για τη δοκιμή νέων θεραπειών με τη χρήση αρχέγονων νευρικών κυττάρων. Επιπλέον μύες στους οποίους έχει αδρανοποιηθεί το γονίδιο της Geminin ειδικά κατά την ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων εμφανίζουν μειωμένη ανοσοαπάντηση. Οι μύες αυτοί θα επιτρέψουν τη μελέτη μηχανισμών που οδηγούν σε ανοσοανεπάρκεια στον άνθρωπο. Επίσης θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλα για μεταμοσχεύσεις, νέων κυτταρικών θεραπειών για το ανοσοποιητικό σύστημα (εφαρμογές στον Αξονα 3 του δικτύου) και για δοκιμή εμβολίων.
·     Διερεύνηση του ρόλου μεταγραφικών παραγόντων στη βιολογία του λιπώδους ιστού στα πλαίσια της συνεισφοράς τους στο μεταβολικό σύνδρομο-σακχαρώδη διαβήτη-δυσλιπιδαιμία-αθηρωμάτωση. Χρησιμοποιούνται μύες στους οποίους έχουν αδρανοποιηθεί τα γονίδια των μεταγραφικών παραγόντων Nrf2 και Keap1, όπως επίσης και πρωτογενείς καλλιέργειες από τους ανωτέρω μύες οι οποίοι διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα και ηπατοκυττάρα. Ανάλυση των φαινοτύπων των μυών στους οποίους απουσιάζει ο Nrf2 και Keap1 μετά από δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λίπη. Ενδεικτικά πειράματα που βρίσκονται σε εξέλιξη, είναι: δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη, δοκιμασία ανοχής στην ινσουλίνη, σωματικό βάρος, κατανάλωση τροφής, μελέτη του σηματοδοτικού μονοπατιού της ινσουλίνης σε διάφορους ιστούς.
·     Γονιδιωματική ανάλυση του νευρικού συστήματος των ζώων που αναφέρονται στα (α), (β) και (γ), μπορεί να πραγματοποιηθεί σε συνεργασία με τον Αξονα 1 και Αξονα 4 του δικτύου προκειμένου να ταυτοποιηθούν γονίδια των οποίων η έκφραση διαφοροποιείται στα μεταλλαγμένα ζώα και τα οποία εμπλέκονται ενδεχομένως και στις αντίστοιχες ασθένειες στον άνθρωπο. Τα γονίδια αυτά μπορεί να εμπλέκονται και στους μοριακούς μηχανισμούς των αντίστοιχων ασθενειών στον άνθρωπο και με αυτό τον τρόπο να βρεθούν νέοι στόχοι προς μελέτη από τον Άξονα 1.
·     Αρχέγονα/προγονικά κύτταρα του νευρικού συστήματος φυσιολογικά είτε γενετικώς τροποποιημένα (πχ να υπερεκφράζουν γονίδια της Geminin, Sox2 κ.α.) σχεδιάζεται να χρησιμοποιηθούν: α) σε πειράματα μεταμόσχευσης για τη θεραπεία ζώων μοντέλων νευροεκφυλιστικών νόσων πχ Παρκισονικά ζώα με 6-ΟΗDA, CREB-/-, β) για τη δοκιμή νέων φαρμάκων που θα συντελούν είτε στην επαγωγή της διαφοροποίησης και της επιβίωσης τους, γ) γενετικώς τροποποιημένα αρχέγονα/προγονικά νευρωνικά κύτταρα μπορούν επίσης να δοκιμαστούν από τον Αξονα 3 για τη δοκιμή νέων θεραπευτικών πρωτοκόλλων.
·     Ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών λειτουργικής απεικόνισης βιομορίων σε κυτταρικό – ιστικό επίπεδο. Βιοτεχνολογική παραγωγή και απομόνωση νέων φθοριζόντων και βιοφωταυγών πρωτεϊνικών ιχνηθετών. Μέθοδοι χημικής σύζευξης βιομακρομορίων για την ανάπτυξη βιοαναλυτικών μεθόδων.
·     Ανάπτυξη μεθοδολογιών δοκιμής νέων βιοδραστικών ουσιών με μεθόδους Λειτουργικής Απεικόνισης σε Ζωντανά κύτταρα. Τεχνολογίες όπως η FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) και μέτρηση FRET επιτρέπουν να προσδιοριστούν πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και λειτουργία σε πλαίσιο του ζωντανού κυττάρου. Οι μέθοδοι αυτές θα εφαρμοστούν για την ανάπτυξη σχημάτων δοκιμής νέων ουσιών με πιθανή φαρμακευτική δράση.
·     Ανάπτυξη στελεχών ζυμομύκητα (ο οποίος αποτελεί άριστο μονοκύτταρο οργανισμό μοντέλο) μέσω επισήμανσης γονιδίων με το πρόσδεμα TAP (TAP-tag) – κατασκευή φαινοτυπικών συστοιχιών.
Εκπαιδευτικοί στόχοι

Τα μέλη του Άξονα θα οργανώσουν δύο Σειρές Πρακτικών Σεμιναρίων (Practical Courses) για προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές στις εξής θεματολογικές ενότητες (βλέπε ‘Αξονα 6):
·     Παρουσίαση και πρακτική εξάσκηση σε Καινοτόμες Μεθόδους Λειτουργικής Μικροσκοπίας και
·     Χρήση γενετικά τροποποιημένων ζωικών μοντέλων στη βιοιατρική έρευνα-την απομόνωση και καλλιέργεια αρχέγονων κυττάρων.
Ένας σημαντικός αριθμός μεταπτυχιακών φοιτητών αναμένεται ότι θα εκπαιδευτεί μέσω των δράσεων του Άξονα.

 


Powered by Joomla! Σχεδίαση - Ανδρέας Παπαδόπουλος